警惕HIV感染者混合感染的潜在危机！BMC Infect Dis：应考虑监测新兴病毒复

在全球范围内，艾滋病防治一直是公共卫生领域的重点关注方向。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染人体后，会持续破坏免疫系统，严重威胁患者的生命健康。近年来，HIV 感染者混合感染的现象逐渐引起了科学界的高度重视。


近期，开普敦大学调查了共感染变体的体内生长是否与假病毒和感染性分子克隆的感染性有关，以确定多样化是否会产生更合适的病毒，并有可能加速疾病进展。结果发表于BMC Infectious Diseases期刊。

doi:10.1186/s12879-024-09805-z

HIV混合感染研究的缘起


自发现HIV以来，已在全球范围内造成了严重的公共卫生危机。据世界卫生组织（WHO）数据显示，截至 2023 年底，全球约有 3840 万人感染 HIV。在我国，每年新报告的 HIV 感染者人数也呈上升趋势。HIV 病毒感染人体后，主要攻击免疫系统中的 CD4+T 淋巴细胞，随着病毒在体内不断复制，CD4+T 细胞数量持续下降，导致人体免疫力逐渐降低，各种机会性感染和肿瘤随之而来，严重影响患者的生活质量和生存期限。


传统的 HIV 治疗方案主要以抗逆转录病毒疗法（ART）为主，通过抑制病毒复制，延缓疾病进展。然而，随着时间的推移，病毒耐药性问题日益凸显，使得治疗效果大打折扣。同时，HIV 病毒具有高度的变异性，这使得疫苗研发困难重重，目前仍没有能够广泛应用的有效疫苗。在这样的背景下，深入研究 HIV 感染的机制，尤其是混合感染的相关问题，对于优化治疗策略、控制疾病传播至关重要。



混合感染现象的发现与研究意义


HIV 感染者混合感染，指的是感染者同时感染两种或两种以上不同基因的 HIV 变体。近年来，越来越多的研究发现，这种混合感染现象并不罕见。一项针对非洲地区 HIV 感染者的调查显示，约有 10%-20% 的患者存在混合感染情况。混合感染可能为病毒的快速扩张和新变体的出现提供机会，进而加速疾病进展。


当 HIV 感染者体内存在多种病毒变体时，病毒之间可能发生重组，产生具有新特性的病毒株。这些新变体可能具有更强的传染性、更高的复制能力，或者对现有治疗药物产生耐药性。此外，混合感染还可能影响人体的免疫反应，使得免疫系统难以有效控制病毒复制。因此，研究 HIV 感染者混合感染，对于揭示病毒进化规律、制定精准治疗方案、评估疾病预后具有重要的科学意义和临床价值。


此前，有研究表明，HIV 病毒在感染人体后，会通过不断变异来逃避免疫系统的攻击。在混合感染的情况下，不同变体之间的相互作用更加复杂，这进一步增加了病毒逃避监测和攻击的能力。了解这些机制，有助于我们更好地理解 HIV 感染的复杂性，为开发更有效的治疗手段提供理论依据。


方 法


1研究对象的选择




本次研究选取了来自南非德班 CAPRISA 002 急性感染研究中的四名 HIV 感染者，分别为 CAP37、CAP84、CAP137 和 CAP267。这些受试者在血清转化之前，就已被确定感染了两种不同基因的 HIV 变体，属于典型的混合感染病例。选择这四名受试者，一方面是因为他们的感染情况较为明确，便于进行长期的跟踪研究；另一方面，他们的感染时间、病情进展等信息相对完整，能够为研究提供丰富的数据支持。


研究团队对这些受试者的 CD4+T 细胞计数等关键指标进行了长期监测和记录。CD4+T 细胞是 HIV 攻击的主要目标，其数量变化能够直观反映免疫系统的受损程度，也是评估 HIV 感染病情进展的重要指标。通过对这些数据的分析，可以更好地了解混合感染对免疫系统的影响。


2实验方法与技术手段




序列分析：研究人员采用单基因组放大（SGA）技术，对四名受试者的 HIV-1 env 基因进行测序分析。共生成了 295 个 SGA 衍生的 env 序列，在受试者入组时（感染后 1-6 周）以及感染后大约 12 周、24 周和 52 周等时间点进行采样分析。通过分析这些序列，可以确定不同变体在体内的频率变化，以及它们之间的遗传关系。利用 MEGA-5 软件计算 DNA 距离，选择在早期感染期间传播的遗传学上最独特的病毒序列作为主序列，通过 Recombination Identification Programme（RIP）分析来确定病毒是否发生重组。


囊膜放大子选择和克隆：从 SGA 衍生的 env 放大子中选择代表性的变体进行克隆，以研究不同变体的特性。使用 Phusion Hot Start DNA 聚合酶扩增 HIV-1 env 基因，将扩增产物克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO 或 pTarget 中。这些克隆的 env 基因可以在后续实验中表达相应的蛋白，用于研究病毒的感染性和免疫原性等。


测定进入效率（EE）：将 env 基因与 pSG3∆Env HIV-1 主干载体共转染 HEK293T 细胞，制备假病毒（PSV）。通过 p24 ELISA 测定病毒滴度，将 PSV 标准化至 100 ng/ml 的 p24 后，感染 TZM-bl 细胞。利用荧光素酶报告基因检测系统，测量感染细胞的相对光单位（RLU），并将每个克隆的 EE 相对于每个受试者的克隆 1（c1）进行表达。EE 反映了病毒进入细胞的能力，是评估病毒感染性的重要指标。


产生感染性分子克隆（IMCs）：对于 CAP137 和 CAP267，研究人员采用改进的酵母间隙修复同源重组方法构建感染性分子克隆。从选定的克隆中扩增全长 HIV-1 env 基因，与线性化的穿梭载体 pCMV-NL4-3-PBS/LTRΔGp160 共转化酿酒酵母。筛选出重组质粒并测序验证，再将重组质粒与辅助质粒共转染 HEK293T 细胞，产生具有复制能力的病毒，并计算组织培养感染剂量（TCID50）。IMCs 可以更真实地模拟病毒在体内的复制过程，有助于深入研究病毒的复制能力和致病机制。


PBMCs 中的复制试验：从 HIV 阴性供体中分离外周血单核细胞（PBMCs），用白细胞介素 - 2（IL-2）和植物血凝素 - P 激活后，感染 300 TCID50 的病毒。在感染后第 7 天、第 10 天和第 14 天收集培养基，检测 p24 浓度。通过比较不同病毒在 PBMCs 中的复制情况，分析病毒的复制能力。以 NL4-3 HIV-1 前病毒作为阳性对照，模拟感染作为阴性对照，确保实验结果的准确性和可靠性。


Env 对恩夫韦肽的敏感性测试：将 PSV 与不同浓度的恩夫韦肽（T20）在 37℃下预孵育 1 小时，然后感染 TZM-bl 细胞。培养 48 小时后，测定 RLU，利用 GraphPad Prism 软件 5.0 计算 50% 抑制浓度（IC50）。T20 是一种进入抑制剂，通过检测 PSV 对 T20 的敏感性，可以间接评估 Env 的融合原性，了解病毒进入细胞的机制以及不同变体的特性差异。


统计分析：使用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）并结合 Bonferroni 校正进行多重比较，分析 EE 和复制能力（RC）的差异；利用 Spearman 相关性检验计算体内频率与体外 EE 之间的关联；通过 Krustal-Wallis 检验和 Dunn 的多重比较检验比较所有时间点的平均成对 DNA 距离。这些统计方法能够帮助研究人员从复杂的数据中提取有价值的信息，准确评估实验结果的显著性和相关性。




结 果


如前所述，CAP37、CAP137和CAP267被高度多样化的变体感染，而感染CAP84的变体在Env内的最大DNA距离仅为3%。重组是共同感染的一个共同特征，我们发现重组主要发生在CAP37、CAP84和CAP137中，尽管有证据表明重组也发生在其他区域内，例如信号肽（图1、2、3和4）。为了确定新兴重组子是否增加了Env EE，我们比较了感染第一年的8、4、10和6个功能Env克隆的PSV EE，这些克隆分别代表感染CAP37、CAP84、CAP37和CAP267的传递和重组变体（表1）。

表1 代表共同感染个体中随时间变化的病毒种群的囊膜克隆

a在文本中，克隆ID可以写成：受试者ID_克隆ID


（一）病毒重组与进入效率的变化




CAP84的感染情况


CAP84最初被检测出感染两种不同基因的 HIV 变体，但全长 env 分析显示其感染的是同质病毒群，推测第二种变体频率过低未被检测到。在感染过程中，4 周时出现了 gp41 序列变化的变体，到 54 周时，gp41 重组体成为主导病毒种群。研究发现，传播变体的频率和 EE 下降，而 EE 较高的重组体逐渐生长。54 周时，gp41 内重组变体的生长与 CD4+T 细胞计数较低同时出现。虽然重组并没有使 EE 相对于传播变体增加，但 1 周和 54 周时相似的 EE 与相似的 CD4+T 细胞计数，暗示了 Env 功能与毒力之间可能存在关联。

图1 CAP84 Env重组和进入效率

（A）使用Highlighter（www.lanl.gov）分析CAP84的全长Env序列，将感染后1周（wpi）、4、10、19和54 wpi的序列与C1（1 wpi）和C2（4 wpi）主序列进行比较。与C1和C2变体相似的序列分别以红色和蓝色显示，而黑线表示两个主序列中均不存在的独特序列。两个主序列共同的序列没有着色。在1、10和54周后克隆的序列用箭头指示。
（B）对代表54周wpi重组Env的序列进行RIP分析，该序列携带了源自C1和C2病毒的gp41区域。C1以红色显示，C2以蓝色指示，顶部一行是查询序列。x轴（k）代表400个碱基对移动窗口中心的查询序列位置。y轴s（k）显示查询序列与C1和C2之间的相似性。
（C）在1、10和54周时比较代表C1（红色）的假病毒（PSV）和重组子（紫色）的进入效率（EE）。PSV EE相对于C1（%）显示，代表三个独立生物重复序列的平均值，误差线指示标准差。每个条的顶部标明了每种病毒的体内频率（%）。CD4 +T细胞计数的下降被用作疾病进展的标志物，并由右侧y轴上的黑色方块显示。只有在Env已克隆或分析的时间点有数据可用时才纳入CD4 +T细胞计数。采用单因素方差分析（Bonferroni修正）进行多重比较。（p <0.05：*，p <0.01：**，p <0.001：***，p <0.0001：****）



CAP37的感染情况


CAP37 在 2 周时感染了高度多样化的共传播变体，21 周后重组体取代了主要种群，并继续进化形成两个主要亚群。起初，频率与 Env EE 之间没有明显关系，但到 52 周时，以 137C6 为代表的重组群体进化出更高的 EE，且与 CD4+T 细胞下降同时发生。这表明，在 CAP37内，随着时间推移，病毒的重组和进化使得某些变体具有更强的感染能力，对免疫系统造成更大的压力。

图2 CAP37 Env重组和进入效率

（A）使用Highlighter（www.lanl.gov）分析CAP37的全长En序列比对，将感染后2周（wpi）、12、21和56周的序列与C1和C3主序列（均来自2周）进行比较。代表C1和C3病毒的序列分别以红色和蓝色显示，而黑线表示两个主序列中均不存在的独特序列。两个主序列共有的序列没有有色。在2周、21周和56周后克隆的序列用箭头表示。
（B）对代表21和56周时重组子的序列的RIP分析表明两个亚群：C5和C6与C1更相似，而C7和C8具有来自恒定区3的额外序列和来自C3的gp41。C1以红色示出，C3以蓝色示出，顶部的一行是查询序列。x轴（k）代表400个碱基对移动窗口中心的查询序列位置。y轴s（k）显示查询序列与C1和C3之间的相似性。
（C）在2周、21周和56周比较了代表感染CAP37的C1（红色）、C3（蓝色）和重组子（紫色）的假病毒（PSV）的进入效率（EE）。PSV EE相对于C1指示，代表三个独立的生物重复序列，误差线指示标准差。每个条的顶部标明了每种病毒的体内频率（%）。CD4 +T细胞计数的下降被用作疾病进展的标志物，并由右侧y轴上的黑色方块显示。只有在Env已克隆或分析的时间点有数据可用时才纳入CD4 +T细胞计数。采用单因素方差分析（Bonferroni修正）进行多重比较。（p <0.05：*，p <0.01：**，p <0.001：***，p <0.0001：****）



CAP137的感染情况


CAP137 在感染 7 周内感染了两种不同基因的病毒，23 周时主导的共传播毒株被重组变体取代。到 52 周时，感染的两个亚群在 gp41 上不同，但携带相似的 C3 和 V4 区域。携带 137C2 gp41 的重组体成为主导变体，且 EE 最高。连续靶向共同传递的变体使得快速重组发生，虽然初期 EE 降低，但进一步选择导致高 EE 重组体生长，这体现了病毒在混合感染环境中的适应性进化。

图3 CAP137 Env重组和进入效率

（A）使用Highlighter（www.lanl.gov）分析CAP137的全长env序列比对，将感染后2周（wpi）、7周、12周、23周和52周的序列与C1和C3主序列进行比较。只有C3克隆代表7 wpi的变体。与C1和C3病毒相似的序列分别以红色和蓝色显示，而黑线表示两个主序列中均不存在的独特序列。两个主序列共同的序列没有着色。在2、7、12、23和52周后克隆的序列用箭头指示。
（B）52周时CAP137重组群体序列的RIP分析鉴定出由C9和C10代表的两个亚群。两个克隆都具有共同的C3亚基因组区域，但C10携带来自C3 gp41的额外序列。C1以红色显示，C3以蓝色指示，顶部一行是查询序列。x轴（k）代表400个碱基对移动窗口中心的查询序列位置。y轴s（k）显示查询序列与C1和C3之间的相似性。
（C）比较了代表感染CAP137的C1（红色）、C3（蓝色）和重组子（紫色）的假病毒（PSV）随时间的进入效率（EE）。相对于C1的PSV EE代表三个独立的生物重复，误差线指示标准差。每个条的顶部标明了每种病毒的体内频率（%）。CD4 +T细胞计数的下降被用作疾病进展的标志物，并由右侧y轴上的黑色方块显示。只有在Env已克隆或分析的时间点有数据可用时才纳入CD4 +T细胞计数。采用单因素方差分析（Bonferroni修正）进行多重比较。（p <0.05：*，p <0.01：**，p <0.001：***，p <0.0001：****）



CAP267的感染情况


CAP267 最初感染的两个种群可能因重组而共享亚基因组区域。6 周时主要种群频率下降，另一种群频率上升并在 52 周成为主导种群。6 周时主导变体的 EE 最高，但随感染进程下降；而第二种变体频率和 EE 都增加。52 周时主导变体未被 nAb 靶向，对应 EE 增加，整体上 Env EE 跟踪了频率变化，显示出病毒变体在感染过程中的动态变化与免疫反应之间的复杂关系。

图4 CAP267 Env重组和进入效率

（A）使用Highlighter（www.lanl.gov）分析CAP267的全长Env序列比对，将感染后6周（wpi）、10周、20周和52周的序列与C1和C2主序列进行比较。代表C1和C2病毒的序列分别以红色和蓝色显示，而黑线表示两个主序列中均不存在的独特序列。两个主序列共同的序列没有着色。不同时间点克隆的序列用箭头指示。
（B）对10周和52周时序列的RIP分析表明，变体代表无明显重组的共传播病毒。C1以红色显示，C2以蓝色指示，顶部一行是查询序列。x轴（k）代表400个碱基对移动窗口中心的查询序列位置。y轴s（k）显示查询序列与C1和C2之间的相似性。
（C）在6周、10周和52周比较了代表感染CAP267的病毒C1（红色）和C2（蓝色）的假病毒（PSV）的进入效率（EE）。相对于C1的PSV EE代表三个独立的生物重复，误差线指示标准差。每个条的顶部标明了每种病毒的体内频率（%）。CD4 +T细胞计数的下降被用作疾病进展的标志物，并由右侧y轴上的黑色方块显示。只有在Env已克隆或分析的时间点有数据可用时才纳入CD4 +T细胞计数。采用单因素方差分析（Bonferroni修正）进行多重比较。（p <0.05：*，p <0.01：**，p <0.001：***，p <0.0001：****）


综合来看，兴重组子在感染后 52 周取代了共传播变体，成为主要群体，且进入效率显著高于其他共循环病毒。这表明重组可能是病毒在混合感染中增强感染能力的重要方式。


（二）包膜与病毒复制适应性的关系



研究发现，对于 CAP84、CAP137 和 CAP267，感染后 1 年频率最高的病毒群体，其 EE 也明显高于同一时间点占主导地位较低的变体。也就是说，总体上，变体的生长可能与 Env EE 增强有关。然而，体内变体频率与体外 PSV EE 之间并没有显著相关性。考虑到 PSV EE 仅反映单轮感染，可能无法代表体内病毒传播情况，研究人员构建了携带 Env 克隆的 pNL4.3 IMCs。结果显示，代表 52 周时主要病毒种群的 IMCs 比主要传播变体具有更高的复制能力（RC），且 PBMCs 中 IMCs 的 RC 与 TZM-bl 细胞中相应 PSV EE 存在显著相关性。

图5 Env函数与变异频率的关系

在第一个时间点和第52周比较了（A）CAP137和（B）CAP267嵌入感染性分子克隆（MHC）的复制能力（RC）。使用斜坡值计算两名BMC供体的平均值和标准差。相对于C1（主要传播变体）来指示进入效率（EE）和RC。每个条的顶部标明了每种病毒的体内频率（%）。采用单因素方差分析（Bonferroni修正）进行多重比较。（p <0.05：*，p <0.01：**，p <0.001：*，p <0.0001：*）。


这进一步证实了 Env 功能的变化对病毒复制适应性的重要影响，表明在体内环境中，病毒的复制能力与进入细胞的效率密切相关，共同影响着病毒的传播和感染进程。


（三）融合性与病毒感染性的关联



由于部分受试者感染的变体在 gp41 上发生重组，研究人员探究了 PSV EE 和 IMC RC 与 T20 IC50 之间的关系。相关性分析表明，EE 和 RC 较高的变体，其融合性也较高。这意味着 PSV EE 的变化可能是由于 gp41 融合原性的变化导致的，而融合性的改变又会影响变体频率。病毒的融合性在病毒感染过程中起着关键作用，它不仅影响病毒进入细胞的效率，还与病毒的复制能力相关，是病毒感染性的重要决定因素之一。在混合感染中，病毒通过重组改变 gp41 的融合原性，可能是其增强感染能力、适应体内环境的重要策略。

图6 Env功能与融合性的相关性

使用Spearman r相关性检验分析了通过T20敏感性测量的融合原性与相应的（A）假病毒（PSV）的Env进入效率（EE）和（B）感染性分子克隆的复制能力（RC）之间的关联。T20 IC50（ng/ml）用作Env融合性的指标。将PSV EE标准化为仅细胞对照，RC表示为源自两个独立实验相对于C1的复制动力学的斜坡平均值。根据之前的报告，相关系数（r）表明存在可忽略的、弱的、中等的、高的和非常高的关系，p值<0.05表示有明显相关。


（四）包膜健康度与疾病进展的联系

图7 Env功能与疾病进展之间的相关性

对假病毒（PSV）进入效率（EE）与CD4 +T细胞计数之间进行了相关性分析。将PSV EE标准化为仅细胞对照，并表示为倍数变化。仅将频率最高的病毒的EE与所有受试者的CD4 +T细胞计数进行比较。根据之前的报告，使用Spearman r检验来表明可忽略不计、弱、中等、高和非常高的关系，p值<0.05表示有明显相关。



已有研究表明 Env EE 与疾病进展指标（如病毒载量和 CD4+T 细胞计数）相关。本研究中，所有受试者在感染第一年 CD4+T 细胞计数均下降，且 CD4+T 细胞损失与 PSV EE 增加之间存在显著相关性。当仅比较频率最高的病毒的 EE 与 CD4+T 细胞计数时，这种关联更为明显。这强烈暗示了病毒的 Env 功能变化会影响疾病进展，感染具有高 Env 驱动 RC 变体的受试者，疾病进展可能会加快。这一结果为评估 HIV 感染者的病情发展提供了重要依据，也提示临床医生在治疗过程中需要密切关注病毒 Env 功能的变化，以便及时调整治疗方案。

思 考



混合感染促进病毒进化与传播


本次研究清晰地表明，HIV 混合感染为病毒变体提供了快速重组的机会，进而产生更具传染性的病毒。在4名受试者中，重组病毒在感染后期占据主导地位，且这些重组变体具有更高的进入效率、融合性和复制能力。这一发现强调了持续监测新兴病毒复制适应性的紧迫性。公共卫生部门和科研人员需要加强对 HIV 变体的监测，及时掌握病毒的进化动态，以便更好地预测疫情走势，制定有效的防控策略。例如，通过对病毒基因序列的实时监测，可以及时发现具有潜在高传播风险的变体，为疫苗研发和药物调整提供依据。



免疫反应与病毒适应性的复杂关系


自身中和免疫反应在 HIV 混合感染中起着关键作用。不同的自身 nAb 反应类型，如 CAP37 的交叉中和、CAP137 的干扰 / 相加反应和 CAP267 的干扰，可能影响更适合病毒的出现。免疫反应与病毒之间的相互作用极其复杂，病毒通过逃逸免疫反应来恢复变体频率，并选择更具适应性的变体。这提示我们，在开发治疗方法和疫苗时，必须充分考虑免疫反应与病毒适应性之间的复杂关系。未来的研究需要深入探讨如何利用免疫反应来抑制病毒复制，同时避免诱导病毒产生更具抗性的变体。例如，在设计疫苗时，可以选择合适的抗原表位，激发机体产生既能有效中和病毒，又不会促使病毒产生耐药性的免疫反应。



对HIV治疗和防控的警示


研究结果显示，感染高 Env 驱动 RC 变体的受试者疾病进展可能加快。这对 HIV 的治疗和防控具有重要警示意义。在临床治疗中，医生需要更加关注患者体内病毒变体的特性，对于感染具有高风险变体的患者，应及时调整治疗方案，采用更有效的治疗手段，以延缓疾病进展。在疫苗研发方面，需要充分考虑病毒变体的多样性和进化趋势，避免疫苗的使用驱动病毒进化出更具抗性的变体。此外，加强对 HIV 感染者的健康教育，提高他们的自我防护意识，减少混合感染的发生，也是防控 HIV 传播的重要措施。



结 论

HIV 感染者混合感染是一个复杂且严峻的问题，对病毒进化、疾病进展和治疗防控都产生了深远影响。通过深入研究混合感染机制，我们能够更好地应对这一挑战，为 HIV 感染者带来更多的希望和曙光。在未来的研究中，我们期待能够进一步揭示混合感染的奥秘，开发出更有效的治疗方法和防控策略，最终实现控制和消除艾滋病的目标。


参考文献：

点分享

点收藏

点点赞
感谢网友投稿51吃瓜来源，若有侵权，联系51吃瓜