DNA疫苗：疫苗领域的 “潜力股”，能否逆袭？

最近几年，疫苗话题备受关注，从新冠疫苗的大规模接种，到各种传染病疫苗的研发，大家对疫苗在预防疾病方面的作用有了更深刻的认识。近期，Journal of Molecular Biology期刊发布了一项研究，来自英国吉尔福德萨里大学与牛津大学的团队论述了一种特殊的疫苗——DNA 疫苗的发展路途。本期内容中，编辑部将带领大家深入了解，看看它在疫苗领域有着怎样的故事。

doi:10.1016/j.jmb.2023.168297

DNA疫苗诞生的台前幕后




（一）传统疫苗的困境

在疫苗发展的历程中，传统疫苗，像灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗，曾立下赫赫战功，帮助人类对抗了许多严重的传染病。但随着时间推移，它们的一些局限性也逐渐显现。


减毒活疫苗虽然免疫效果较好，可它存在一定风险，对于免疫功能低下的人群，有可能引发严重感染；
灭活疫苗安全性高，却往往需要多次接种，而且免疫效果有时不尽如人意；
亚单位疫苗虽然成分明确，安全性也不错，但生产过程复杂，成本较高。


面对一些不断变异的病毒，比如流感病毒、艾滋病病毒，传统疫苗研发周期长，难以快速跟上病毒变异的脚步。这些问题，让科研人员迫切需要寻找新的疫苗技术——DNA 疫苗就在这样的背景下进入了人们的视野。

图1. DNA疫苗发现、人体临床试验和许可疫苗的时间轴

20世纪90年代，DNA疫苗的概念证明得到了证明，导致了第一个十年内的首次人体I期临床试验。自2001年以来，ClinicalTrials.gov数据库中报告了198项人体I期和62项I/II期和II期临床试验已终止/完成。只有两项人体II/III期临床试验被终止/完成，并且只有一种疫苗已获得用于人类的批准，均针对Sars-CoV-2。六种动物DNA疫苗已获得许可。
* 表示2001年至2023年9月7日期间在ClinicalTrials.gov上登记为终止/完成的研究数量。
HIV：人类免疫缺陷病毒，IHNV：传染性骨髓坏死病毒，SAV3：鲑鱼甲病毒亚型3，WNV：西尼罗河病毒。



（二）DNA 疫苗的起源与发展



DNA 疫苗的历史可以追溯到 20 世纪 60 年代。1960 年，伊藤等人发现，给兔子注射肿瘤源性乳头瘤病毒的 DNA 片段，竟然能诱导兔子产生肿瘤。这一现象表明，纯化的 DNA 可以在体内进入哺乳动物细胞，还能表达出相应的蛋白质。不过在当时，这个发现并没有引起太多关注，很多人对此持怀疑态度。


到了 1990 年，Wolf 等人有了新突破。他们给小鼠肌肉注射一种编码报告基因的 DNA 质粒，结果发现小鼠肌肉细胞成功被转染，还表达出了报告分子。这一成果为 DNA 疫苗的发展奠定了重要基础。


1992 年，Tang 团队带来了更令人惊喜的消息，他们把人生长激素和人 α - 抗胰蛋白酶基因，在特定启动子的控制下导入小鼠体内，成功诱导小鼠产生了相应的抗体，还首次记录了无针基因枪输送系统的使用。此后，越来越多的研究表明，DNA 疫苗不仅能诱导产生抗体，还能激发 T 细胞反应，对多种疾病都有潜在的保护作用，这让 DNA 疫苗迅速成为疫苗领域的 “新星”。


随后的几十年里，DNA 疫苗的研究不断推进。20 世纪 90 年代，其概念得到验证后，很快进入人体临床试验阶段。虽然在临床试验过程中遇到了不少困难，比如免疫原性低等问题，但科研人员从未放弃探索。如今，DNA 疫苗在动物医学领域已经取得了不少成果，多种动物 DNA 疫苗获得许可，在人类医学领域，也在不断努力突破，寻找更有效的应用方式。

表1.获得兽医使用许可的DNA疫苗

IM:肌内注射;ID:皮内。



DNA是如何发挥作用的




（一）进入细胞的奇妙之旅

DNA 疫苗要发挥作用，第一步就是进入宿主细胞。目前发现，它主要有三种进入细胞的方式。


第一种，像 “走后门” 一样，通过细胞膜上临时出现的小孔进入。这些小孔可能是细胞自然产生的，DNA 质粒借助自然扩散的力量，顺着小孔就溜进了细胞内。
第二种方式是通过微胞饮作用，这其中又分为受体介导的内吞作用和小窝内吞作用。受体介导的内吞作用就像是细胞伸出 “小手”，用细胞膜上的受体，比如网格蛋白受体，抓住 DNA 质粒，把它裹进细胞里；小窝内吞作用则是细胞把细胞膜向内凹陷，形成小窝，把细胞外的 DNA 质粒吞进去。
最后一种方式有点 “暴力”，就是直接破坏细胞膜。用针穿刺或者利用静水压等方式，在细胞膜上制造出大洞，让 DNA 质粒能够顺利进入细胞。而且研究发现，这种主动破坏细胞膜的方式，还能大幅增加 DNA 在肌肉肌纤维、肝细胞等多种组织中的表达。


（二）抗原的生产与加工

DNA 质粒进入细胞后，并没有停下脚步，它还要前往细胞核，就像找到了 “指挥中心”。在细胞核里，DNA 质粒作为模板，开始进行转录和翻译，最终表达出抗原。这些抗原和细胞内其他蛋白质一样，要经历翻译后修饰，像糖基化、折叠等过程，让自己变得 “成熟”。


根据抗原自身的特点，尤其是信号序列的不同，它们的 “命运” 也不一样。有的抗原会被分泌到细胞外，成为可溶性蛋白；有的会触发细胞内的炎症反应；还有的会被呈现在主要组织相容性复合物（MHC）上。


正是通过这些不同的 “路径”，DNA 疫苗编码的抗原成功激活了人体的先天免疫系统和适应性免疫系统，让身体做好对抗病原体的准备。


（三）抗原呈递引发免疫反应

抗原加工完成后，就要开始呈递给免疫细胞，引发免疫反应了。这里主要有四条 “路线”。


第一条路线是 “经典路线”——内源性抗原在细胞质中被蛋白酶分解成小肽，然后装载到 MHC - I 分子上，这个过程能激活具有细胞毒性的 CD8+T 细胞，让它们去识别和消灭被病原体感染的细胞。


第二条路线中，内源性抗原在细胞内体被蛋白酶降解，再由 MHC - II 分子呈递，激活 CD4+T 细胞。


第三条路线是交叉呈递途径，外源性抗原在细胞质、低 pH 内体或者通过吞噬溶酶体相关蛋白酶的作用被降解，之后在 MHC - I 分子上呈递，这条路线也能激活 CD8 + T 细胞。


第四条路线里，外源性抗原通过吞噬溶酶体进入细胞，被蛋白酶破坏后，装载在 MHC - II 分子上，再转移到细胞表面，激活 CD4+T 细胞，还能促进 B 细胞产生特异性抗体。这四条路线相互配合，共同启动了人体的免疫反应，为身体筑起一道坚固的防线。

图2. DNA疫苗的细胞感染可能会发生抗原加工的四种主要途径

APCs的直接感染会导致内源性表达的抗原的加工，而体细胞的感染会导致抗原的细胞外分泌。(A)在抗原加工的“经典”途径中，蛋白酶将内源性抗原分解为细胞质中更小的肽，将它们装载到细胞内质网中的MHC-I分子上。(B)内源性抗原也可以被细胞核内体中的蛋白酶降解，由MHC-II分子提呈。(C)在交叉递呈途径中，外来抗原可以被胞质中的蛋白酶、低pH核内体中的蛋白酶或通过吞噬线粒体相关蛋白酶的作用降解。吞噬胞浆与内质网融合后，降解抗原的肽可能会被提呈在MHC-1分子上。(D)或者，通过吞噬胞内化的外来抗原被蛋白酶破坏并负载在吞噬胞室内的MHC-II分子上，然后转移到细胞表面。



DNA疫苗的临床成果与挑战




（一）动物医学领域的成功

在动物医学领域，DNA 疫苗成绩斐然。2005 年，美国疾病控制与预防中心和道奇堡动物健康公司合作研发的西尼罗河病毒马 DNA 疫苗，成为世界上首个获得许可的 DNA 疫苗。它不仅能保护马匹免受西尼罗河病毒的侵害，在多种野生鸟类中也展现出良好的应用前景。同年，诺华公司生产的针对传染性造血坏死病毒的 DNA 疫苗，也获得用于鲑鱼的许可。2016 年，Elanco Animal Health 公司研发的 Clynav® 疫苗，能保护大西洋鲑鱼免受鲑鱼胰腺病的困扰，成为欧盟批准的首个 DNA 疫苗。


除了传染病疫苗，DNA 疫苗在动物癌症免疫疗法和基因疗法方面也有出色表现。2008 年，一种通过电穿孔接种的治疗性 DNA 疫苗，用于猪的动物医学，能降低围产期母猪的发病率和死亡率，提高生产效率。2010 年，美国农业部批准的用于治疗狗口腔恶性黑色素瘤的 Oncept® 疫苗，也是 DNA 疫苗的成功范例。这些成果充分证明了 DNA 疫苗在动物医学领域的可行性和有效性。


（二）人体临床试验的坎坷

相比动物医学，DNA 疫苗在人体临床试验中就没那么顺利了。


1998 年，麦格雷戈团队进行了 HIV-1 感染 DNA 疫苗的人体 I 期临床试验，虽然接种后患者出现了特异性免疫反应，但疫苗的功效并不明确。此后，针对各种传染病、癌症等的 DNA 疫苗临床试验纷纷展开，数百项研究结果显示，DNA 疫苗在人体中的免疫原性较低，这成为它在人体应用中最大的 “拦路虎”。


为了提高 DNA 疫苗在人体中的免疫原性，科研人员尝试了很多方法。比如使用佐剂，佐剂就像是疫苗的 “小助手”，能增强免疫反应。传统的佐剂，像铝盐、油包水乳液等，在小鼠模型中效果不错，但在大型动物和人体试验中却不尽人意。


后来，科研人员把目光转向佐剂，像细胞因子、趋化因子等。IFN - c 能激活免疫细胞、增强 MHC 分子表达，与 DNA 疫苗联合使用，在小鼠实验中能增强抗原特异性细胞反应和体液反应，但在非人灵长类动物实验中效果却不明显。GM - CSF 能招募抗原呈递细胞、促进 T 细胞激活，对很多 DNA 疫苗都有增强免疫反应的作用，可它的效果受免疫方案、免疫原等多种因素影响，有时还会出现降低抗体水平的情况。IL - 12 在一些动物实验和人体临床试验中，能增强 DNA 疫苗的免疫原性，提高 CD4 + T 细胞反应率，加速抗体产生，但在某些疫苗中效果也不显著。


除了佐剂，改进递送系统也是提高免疫原性的重要方法。电穿孔技术通过施加电脉冲，让细胞膜出现小孔，帮助 DNA 进入细胞，能增强载体吸收和抗原表达，提高免疫反应，但可能会造成组织损伤和炎症。基因枪技术把 DNA 包被在重金属颗粒上，打入细胞内，虽然能有效引发免疫反应，可设备和试剂成本高，还难以控制 DNA 的插入位点。微针阵列和喷射注射等技术，也都在提高 DNA 疫苗免疫原性方面各有优势，但也面临一些挑战。


不过，也有令人振奋的好消息。针对COVID-19 研发的 ZyCoV - D® 疫苗，在 2021 年获得紧急使用授权。它是一种皮内注射的无针疫苗，稳定性好，在临床试验中表现出良好的耐受性，能诱导出针对新冠病毒的体液和细胞免疫反应，为全球抗击疫情贡献了一份力量。




DNA疫苗，未来何去何从？


（一）现有优势不可忽视

尽管 DNA 疫苗在发展过程中面临诸多挑战，但它的优势也十分明显。


从免疫反应角度看，它能同时激活体液免疫和细胞免疫，编码的抗原可以通过 MHC I 类和 II 类分子呈递，激活 CD4 + 和 CD8+T 细胞，为身体提供更全面的免疫保护。而且，DNA 疫苗具有内在的免疫刺激特性，能通过多种机制激活先天免疫反应。


在疫苗设计和生产方面，DNA 质粒操作方便，只要知道病原体的基因序列，就能快速设计和生产疫苗，可用于应对突发传染病；且它的生产过程减少了对动物或细胞产品的依赖，成本相对较低。


另外，DNA 疫苗稳定性强，不需要特殊的冷藏条件，便于储存和运输，这在全球疫苗供应，尤其是发展中国家的疫苗接种中，具有很大的优势。


（二）面临的挑战仍需攻克

当然，DNA 疫苗想要在人类医学领域广泛应用，还有不少难题需要解决。免疫原性低的问题依旧突出，虽然尝试了各种方法，但目前还没有完全找到提高免疫原性的最佳方案。安全性方面，虽然整合到宿主基因组的风险较低，但长期抗原表达是否会导致免疫耐受，还需要进一步研究。而且，DNA 疫苗递送装置从非临床到临床的转化也存在困难，不同地区对装置和疫苗的监管要求不同，增加了产品研发的难度。


（三）未来充满希望

尽管困难重重，但 DNA 疫苗的未来依然充满希望。在个性化医疗方面，它有着独特的潜力。可以根据患者的具体情况，设计个性化的 DNA 疫苗，用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。而且随着技术的不断进步，新的佐剂、递送系统可能会不断涌现，有望解决当前面临的问题。在应对突发传染病时，DNA 疫苗快速研发的优势也能发挥更大作用。


只要科研人员持续探索，不断优化技术，DNA 疫苗或许能在未来的医学领域大放异彩，成为守护人类健康的有力武器。




DNA 疫苗就像是一只正在成长的 “潜力股”，虽然目前还面临一些困境，但它的发展前景值得期待。相信在科研人员的不懈努力下，DNA 疫苗未来能为人类健康带来更多惊喜。大家不妨持续关注，见证它在医学领域的每一次突破。

参考文献

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